Por qué una mezcla es más que la suma de sus partes

Resumen

Se realizó un perfil de expresión génica en la línea celular neuroglial humana T98G tras el tratamiento con el adaptógeno ADAPT-232 y sus constituyentes: extractos de raíz de Eleutherococcus senticosus, baya de Schisandra chinensis y raíz de Rhodiola rosea, así como varios constituyentes de forma individual, a saber, eleuterósido E, esquizandrina B, salidrósido, triandrina y tirosol. Una característica común a todos los adaptógenos ensayados fue su efecto sobre las vías de señalización de los receptores acoplados a proteínas G, es decir, las vías de transducción de señales del AMPc, de la fosfolipasa C (PLC) y del fosfatidilinositol. Los adaptógenos podrían reducir el nivel de AMPc en las células cerebrales mediante la regulación a la baja del gen de la adenilato ciclasa ADCY2 y la regulación al alza del gen de la fosfodiesterasa PDE4D, lo cual es esencial para la homeostasis energética, así como para el paso de estados catabólicos a anabólicos y viceversa. La regulación a la baja del AMPc por los adaptógenos podría reducir la actividad de la proteína quinasa A dependiente de AMPc en distintas células, lo que da lugar a la inhibición de las transformaciones catabólicas inducidas por el estrés y al ahorro de ATP para muchas transformaciones metabólicas dependientes de ATP. Todos los adaptógenos ensayados regularon al alza el gen PLCB1, que codifica la PLC específica de fosfoinosítidos y las fosfatidilinositol 3-quinasas (PI3K), actores clave en la regulación de las respuestas de defensa mediadas por NF-κB. Otras dianas comunes de los adaptógenos incluyeron genes que codifican el receptor de estrógenos ER (regulación a la baja de 2,9 a 22,6 veces), la proteína de transferencia de ésteres de colesterol (regulación a la baja de 5,1 a 10,6 veces), la proteína de choque térmico Hsp70 (regulación al alza de 3,0 a 45,0 veces), el inhibidor de la peptidasa serpina (neuroserpina) y el receptor 5-HT3 de la serotonina (regulación a la baja de 2,2 a 6,6 veces). Estos hallazgos pueden conciliarse con los efectos beneficiosos observados de los adaptógenos en trastornos conductuales, mentales y asociados al envejecimiento. La combinación de dos o más sustancias activas en una misma mezcla modifica de forma significativa los perfiles de genes desregulados: las interacciones sinérgicas dan lugar a la activación de genes que ninguna de las sustancias individuales afectaba, mientras que las interacciones antagónicas dan lugar a la supresión de algunos genes activados por las sustancias individuales. Estas interacciones pueden influir en el control transcripcional de la regulación metabólica, tanto a nivel celular como a nivel del organismo completo. La fusión de los perfiles de matrices de genes desregulados y de las redes intracelulares es específica de la nueva sustancia, con características farmacológicas únicas. Presumiblemente, este fenómeno podría aprovecharse para eliminar efectos indeseables (por ejemplo, efectos tóxicos) y aumentar la selectividad de la intervención farmacológica.

Introducción

El término adaptógeno se introdujo en la literatura científica en la década de 1950 para referirse a sustancias que aumentan el «estado de resistencia inespecífica» en condiciones de estrés (Lazarev, 1958; Lazarev et al., 1959). El concepto de adaptógeno se basó en la teoría del estrés (Selye, 1950), definido inicialmente como un estado de homeostasis amenazada, y en un síndrome general de adaptación caracterizado por una respuesta inespecífica del organismo ante diversos factores de estrés (físicos, emocionales, ambientales, etc.). Se ha postulado que los adaptógenos deben ser seguros y capaces de normalizar las funciones corporales con independencia de la naturaleza de los factores de estrés (Brekhman II y Dardymov, 1969). En los albores del nuevo milenio, la definición de adaptógeno se actualizó a «una nueva clase de reguladores metabólicos que aumentan la capacidad de un organismo para adaptarse a los factores ambientales y evitar el daño causado por dichos factores» (Panossian et al., 1999a). El concepto de adaptógeno goza hoy de aceptación general en la comunidad científica (EMEA/HMPC/102655/, 2007; Samuelsson y Bohlin, 2009), aunque todavía no ha alcanzado protagonismo en la farmacología convencional. En este contexto, los avances recientes de la investigación han adoptado dos formas principales: se ha generado evidencia clínica convincente sobre la eficacia de los adaptógenos, a partir de ensayos clínicos realizados conforme a las normas de buena práctica clínica de la Conferencia Internacional de Armonización (ICH) (Davydov y Krikorian, 2000; Goulet y Dionne, 2005; Sarris, 2007; Bleakney, 2008; Panossian y Wikman, 2009, 2010; Dwyer et al., 2011; Hung et al., 2011; Iovieno et al., 2011; Sarris et al., 2011; Chan, 2012; Ishaque et al., 2012), y se definieron algunos mecanismos moleculares clave de la actividad de los adaptógenos (Panossian et al., 2007, 2009, 2012).

La actividad protectora frente al estrés de los adaptógenos se asocia con la regulación de la homeostasis en dos niveles: a nivel sistémico, mediante varios mecanismos de acción vinculados al eje hipotálamo-hipófiso-suprarrenal (HPA), y a nivel celular, mediante la activación de chaperonas moleculares, principalmente las proteínas hsp70, y la regulación de mediadores clave de la respuesta al estrés, entre ellos el neuropéptido Y (NPY), el cortisol, el óxido nítrico, la proteína quinasa activada por estrés JNK y el factor de transcripción forkhead box O (Panossian et al., 2007, 2009, 2012; Wiegant et al., 2009).

En general se acepta un papel importante del sistema nervioso central (SNC) en el estrés, dado que el concepto de estrés fue definido por Selye (Fink, 2000). El efecto de los adaptógenos sobre el SNC, en particular su actividad neuroprotectora, se ha demostrado en numerosos estudios en animales y en humanos (Panossian y Wikman, 2010; Panossian et al., 2011). La eficacia clínica de los adaptógenos en trastornos conductuales y mentales como la depresión, la ansiedad, el trastorno bipolar y la fatiga crónica e inducida por el estrés se ha revisado recientemente (Panossian y Wikman, 2009, 2010).

ADAPT-232 (Chisan) es un producto medicinal herbario tradicional que consiste en una combinación fija de extractos de raíz de Rhodiola rosea, baya de Schisandra chinensis y raíz de Eleutherococcus senticosus. Se toma frente al rendimiento corporal disminuido, como la fatiga y la debilidad (Bogatova et al., 1997; Narimanian et al., 2005; Aslanyan et al., 2010). En general, las mezclas herbarias ejercen sus bioactividades a través de interacciones sinérgicas de sus componentes individuales. Este sinergismo puede atribuirse a que las hierbas medicinales contienen muchos fitoquímicos distintos, que pueden influir mutuamente en la actividad de unos y otros. Se han identificado más de 140 compuestos en las raíces de R. rosea (Panossian y Wikman, 2010), 100 compuestos en las raíces de E. senticosus (Huang et al., 2011) y alrededor de 200 compuestos en las bayas de S. chinensis (Panossian y Wikman, 2008). Se demostró que muchos de ellos son activos en experimentos farmacológicos in vivo e in vitro y que probablemente contribuyen a la actividad de los extractos totales (Wagner et al., 1994; Panossian, 2003; Panossian y Wagner, 2005, 2011; Panossian y Wikman, 2008, 2010; Panossian et al., 2008; Huang et al., 2011). Se ha demostrado que la actividad adaptogénica de ADAPT-232 se asocia con mediadores clave de la respuesta al estrés, por ejemplo, las proteínas de choque térmico (Hsp70) y el NPY, implicados en la regulación de la homeostasis, el estrés oxidativo, el metabolismo energético, la función cognitiva y la activación del sistema inmunitario durante la fatiga y el agotamiento (Prodius et al., 1997; Panossian et al., 2009). Sin embargo, los modos de acción celulares y moleculares no se comprenden bien, debido a que los remedios herbarios en general tienen múltiples dianas y varios mecanismos, en lugar de un único mecanismo, que podrían explicar sus efectos farmacológicos.

Cualquier efecto farmacológico representa una respuesta integrada de un organismo al fármaco. La respuesta puede asociarse con interacciones entre el fármaco y la célula en distintos niveles de regulación: el nivel de las pequeñas moléculas fisiológicamente activas; por ejemplo, el AMPc desempeña un papel importante en la respuesta integradora del organismo. Este es el llamado nivel metabolómico, ya que el ATP es un precursor del AMPc y el AMP es un metabolito. El nivel de las proteínas implicadas en la síntesis o la degradación de ligandos o de receptores de ligandos. Este es el llamado nivel proteómico de regulación. Los genes que codifican proteínas implicadas en la síntesis, la degradación, la recepción de señales y la regulación. Este es el llamado nivel genómico y transcripcional de regulación.

La activación o la supresión de la expresión génica da lugar a la activación o la inhibición de la biosíntesis de las proteínas codificadas (enzimas, cofactores o receptores), lo que a su vez afecta a la producción y la función de las pequeñas moléculas activas. Los perfiles de expresión génica ayudan a rastrear las interacciones moleculares y las vías de transducción de señales, y a predecir el efecto farmacológico que un fármaco tendrá sobre diversas funciones celulares.

Recientemente se han establecido las llamadas tecnologías «ómicas» para el análisis de los efectos farmacológicos (Ulrich-Merzenich et al., 2007; Sarris et al., 2012). Dado que la transcriptómica y la proteómica pueden monitorear de forma exhaustiva los cambios celulares en la expresión de genes o proteínas tras el tratamiento farmacológico, estas técnicas pueden resultar sumamente adecuadas para investigar los mecanismos multifacéticos de las fórmulas herbarias. Por ello, hemos analizado los perfiles de expresión de ARNm de todo el transcriptoma, basados en microarrays, de la línea celular neuroglial T98G tras la exposición a ADAPT-232 y a sus componentes herbarios, R. rosea, S. chinensis y E. senticosus.

La elección de la línea celular de neuroblastoma T98G para nuestro estudio se basa en los resultados obtenidos en numerosas publicaciones (Stein, 1979; Guzhova et al., 2001; Su et al., 2012). En el sistema nervioso central, aproximadamente el 90% de las células son glía. Se ha demostrado que la glía cumple varias funciones, entre ellas servir de enlace de transporte entre el torrente sanguíneo y las neuronas, la captación de neurotransmisores, la síntesis y la liberación de factores neurotróficos, la regulación inmunitaria y la modulación de la actividad sináptica (Henn y Hamberger, 1971; Haydon, 2001; Ullian et al., 2001). La glía contribuye a la defensa del cerebro mediante la expresión de la respuesta inmunitaria innata, favoreciendo la eliminación de proteínas neurotóxicas y de células apoptóticas del SNC, así como regulando la entrada de células sistémicas inflamatorias al cerebro en la barrera hematoencefálica (Nguyen et al., 2002; Hauwel et al., 2005). Esto estimula tanto la reparación tisular como la rápida restauración de la homeostasis tisular. Una función fisiológica importante de las células neurogliales es el aporte metabólico de energía y de otras sustancias, con el mantenimiento de la homeostasis cerebral, una función que, por definición, se supone característica de los adaptógenos. Las células gliales expresan diversos receptores hormonales, que son críticos durante las enfermedades inducidas por el estrés. Las células gliales expresan receptores de esteroides y generan muchas hormonas esteroideas que provocan efectos rápidos no genómicos sobre las neuronas, tanto a través de receptores acoplados a proteínas G unidos a la membrana como de receptores genómicos nucleares que se sabe que activan la síntesis de ARN y de proteínas (Bennett, 2000). Guzhova et al. (2001) muestran que las células de glioma exportan Hsp70 al medio de cultivo, ya sea en condiciones normales o sometidas a choque térmico. La glía puede liberar Hsp70 y la Hsp70 exógena puede aumentar la tolerancia neuronal al estrés (Guzhova et al., 2001). Por último, la capacidad de los astrocitos, pero no de las neuronas, para prevenir la inflamación por macrófagos y linfocitos T en el SNC, para atenuar la pérdida axonal y la gliosis, con la consiguiente neuroprotección en la encefalomielitis autoinmune experimental, el modelo murino de esclerosis múltiple más utilizado (Spencea et al., 2011), fue la razón para seleccionar células neurogliales en nuestros estudios dedicados a comprender los mecanismos moleculares de acción de los adaptógenos.

El objetivo de la investigación fue comparar las similitudes y las diferencias en los perfiles de expresión génica tras el tratamiento con estas tres plantas adaptogénicas. Comparamos los dos extractos vegetales ADAPT-232 y ADAPT-232 forte (que tiene la misma composición que ADAPT-232, salvo que también incluye la vitamina antiestrés, el pantotenato de calcio). También comparamos estas dos mezclas de composición fija con compuestos activos individuales aislados de estas plantas, a saber, salidrósido, triandrina, tirosol, eleuterósido E y esquizandrina B (Figura 1). Este análisis farmacogenómico facilita una mayor comprensión de los modos de acción moleculares de los adaptógenos y del sinergismo de ADAPT-232 forte.

Materiales y métodos

Fármacos y sustancias químicas

El eleuterósido E, el esquizandrina B, el salidrósido y el tirosol se adquirieron a Chromadex (Irvine, CA, EE. UU.). El triandrina se aisló en el departamento de Investigación y Desarrollo del Swedish Herbal Institute (SHI) (Gotemburgo, Suecia) y se identificó por comparación (HPLC, TLC, UV) con la muestra de referencia auténtica proporcionada amablemente por la Prof.ª Zapesoznaya (Instituto de Plantas Oficinales y Aromáticas VILAR, Moscú, Rusia). Los extractos estandarizados de grado farmacéutico de raíces de R. rosea L., raíces de E. senticosus (Rupr. et Maxim) Harms y bayas de S. chinensis (Turcz.) Baill. se fabricaron conforme a las directrices ICH Q7A y EMEA de Buenas Prácticas Agrícolas y de Recolección (GACP) y de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP) de ingredientes farmacéuticos activos (API). Anteriormente describimos en detalle la composición y la caracterización química de ADAPT-232 y ADAPT-232 forte (Panossian et al., 2009, 2012; Aslanyan et al., 2010). El contenido de los extractos vegetales y de sus marcadores activos era el mismo en ambas preparaciones de adaptógenos; la única diferencia era la presencia de pantotenato de calcio en ADAPT-232 forte. Las muestras de trabajo utilizadas en los experimentos se prepararon por dilución de soluciones madre (5 mg/mL) de ADAPT-232, ADAPT-232 forte, extracto genuino de Radix Eleutherococci, extracto genuino de Radix Rhodiola y extracto genuino de Fructus Schisandrae, o de soluciones 10 mM de marcadores analíticos purificados: salidrósido (3 mg/mL), triandrina (3,1 mg/mL), eleuterósido E (7,4 mg/mL), esquizandrina B (4 mg/mL) o tirosol (1,4 mg/mL), con volúmenes apropiados de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añadieron soluciones de trabajo de 200 µL a 3 mL de cultivo celular para obtener las mismas concentraciones finales de marcadores activos y de extracto genuino que en los medios de incubación de ADAPT-232 y ADAPT-232 forte (Tabla 1). Una excepción fue la muestra de ensayo B, en la que la concentración era 100 veces menor que en la muestra de ensayo A.

La dosis de 300 µg/mL (concentración final de ADAPT-232 forte en el medio de incubación) se basa en los resultados de un estudio farmacocinético reciente del salidrósido derivado de R. rosea en plasma sanguíneo humano, en el que medimos concentraciones de 1 µg/mL = 3 µM (Panossian et al., 2010). No obstante, en experimentos in vitro recientes se observó una regulación al alza de HSF1, Hsp72 y NPY a concentraciones de ADAPT-232 forte 100 veces menores (Panossian et al., 2012). Por ello, en la presente investigación ADAPT-232 forte se ensayó en dos concentraciones, 300 y 3 µg/mL (Tabla 1). Las concentraciones de los extractos totales de los tres ingredientes herbarios y de sus constituyentes activos son compatibles en todas las muestras de ensayo: por ejemplo, la concentración final de salidrósido es la misma, 3 µM (900 µg/L), en todas las muestras de ensayo que contienen salidrósido, a saber, el extracto de Rhodiola, ADAPT-232 y ADAPT-232 forte. De igual manera, para el esquizandrina B, el eleuterósido E, el triandrina y el tirosol, sus concentraciones se calcularon a partir de los resultados del análisis por HPLC de su contenido en los extractos genuinos y en sus combinaciones. Las concentraciones de los extractos genuinos se calcularon utilizando las especificaciones de sus combinaciones (ADAPT-232 y ADAPT-232 forte) para asegurar que correspondieran a dosis terapéuticamente eficaces.

Cultivo celular

La línea celular neuroglial humana T98G se adquirió a la American Type Culture Collection (ATCC, CRL-1690). Las células se cultivaron en DMEM+GlutaMAX-I (Gibco, Darmstadt, Alemania) con un 10% de suero fetal bovino (Gibco, Darmstadt, Alemania) y un 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco, Darmstadt, Alemania). Se subcultivaron dos veces por semana y se mantuvieron en un incubador a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Todos los experimentos se realizaron utilizando células en la fase de crecimiento logarítmico.

Tratamiento farmacológico

Las células T98G se sembraron 24 h antes del tratamiento en placas de 6 pocillos a una densidad de 150 000 células por pocillo. Al día siguiente, se retiró el medio antiguo y las células se trataron en un volumen final de 3 mL (Tabla 1).

El contenido de etanol fue del 0,8% para las células tratadas con compuestos aislados y para las células control tratadas con el vehículo (muestra de ensayo Z). Se realizaron dos réplicas técnicas para cada muestra. Las células se incubaron con las sustancias de ensayo durante 24 h a 37 °C y luego se sometieron al aislamiento de ARN.

Aislamiento de ARNm y control de calidad

Las células se recogieron tras 24 h de tratamiento. El ARN total se aisló mediante el kit InviTrap Spin Universal RNA Mini (Stratec Molecular, Berlín, Alemania) y se disolvió en agua libre de ARNasa. El ARN de las dos réplicas técnicas se combinó (1:1), lo que dio lugar a una muestra por cada tratamiento/control. La calidad del ARN total se comprobó mediante análisis en gel con el ensayo Total RNA Nano chip en un Bioanalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies GmbH, Berlín, Alemania). Todas las muestras eran de la máxima calidad, con valores de RIN de 10.

Perfilado de la expresión génica

Las hibridaciones de microarrays se realizaron en el Instituto de Biología Molecular (Maguncia, Alemania). Para el perfil de expresión génica se utilizaron chips de ARN de genoma humano completo (860K de Agilent). Los procedimientos de marcaje de sondas y de hibridación se llevaron a cabo siguiendo el One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis Protocol1. En resumen, el ARN total se marcó y se convirtió en ADNc. A continuación, se sintetizó ARNc fluorescente (cianina 3-CTP) y se purificó con el kit QIAgen RNeasy. Tras la fragmentación del ARNc, las muestras se hibridaron durante 17 h a 65 °C. Los portaobjetos de microarrays se lavaron y se escanearon con el sistema Agilent Microarray Scanning. Las imágenes se analizaron y se extrajeron los datos. Se sustrajo el fondo y los datos se normalizaron mediante los procedimientos estándar del software Agilent Feature Extraction.

Análisis de los datos de microarrays

Los datos de expresión se analizaron adicionalmente con el software Chipster2 para filtrar los genes según la variación de su expresión y su significación. Estos pasos incluyen el filtrado de genes para aislar los que estaban regulados al alza o a la baja entre una y tres veces la desviación estándar (según el número total de genes extremadamente regulados al alza o a la baja). Una evaluación posterior de la significación mediante la prueba t de Bayes empírica redujo aún más el conjunto de genes. Todos los genes considerados a continuación mostraron una diferencia significativa respecto al control, con un valor de p<0,05, salvo que se indique lo contrario. Por último, los datos filtrados se utilizaron en el análisis de vías Ingenuity, en el análisis Core, para determinar las redes y las vías influidas por los tratamientos farmacológicos3.

RT-PCR en tiempo real

El coeficiente de correlación entre los valores de expresión de ARNm determinados por hibridación de microarrays y por RT-PCR en tiempo real fue R=0,81 (prueba de correlación de Pearson), Tabla 3.

Resultados

Se realizó un análisis de la expresión de ARNm de todo el transcriptoma basado en microarrays para identificar posibles dianas de las sustancias ensayadas en las células T98G. Las células T98G se trataron con las sustancias de ensayo durante 24 h en dos réplicas técnicas antes de aislar el ARN total y combinarlo para la hibridación de microarrays. Los genes significativamente desregulados se identificaron en comparación con los controles no tratados (p<0,05) mediante el análisis con el software Chipster. Los análisis de vías Ingenuity se realizaron con conjuntos de datos de genes significativamente regulados al alza o a la baja: 536 genes para ADAPT-232 forte, 777 genes para ADAPT-232 forte ensayado a la concentración baja, 534 genes para ADAPT-232 a la concentración más alta, 591 genes para el extracto de Eleutherococcus, 599 genes para el extracto de Schisandra, 561 genes para el extracto de Rhodiola, 567 genes para el eleuterósido E, 620 genes para el esquizandrina B, 640 genes para el salidrósido, 601 genes para el triandrina y 562 genes para el tirosol. Los diagramas de Venn de la Figura 2 muestran el número de genes desregulados exclusivos de cada extracto de tratamiento en comparación con el número de genes desregulados comunes. La Tabla 4 muestra las principales funciones celulares y redes afectadas de forma más significativa por los distintos adaptógenos. Las Tablas 5 y 6 muestran los genes regulados al alza o a la baja por los adaptógenos.

Los valores muestran los cambios de expresión (veces) respecto al control. (+) Indica regulación al alza. (−) Indica regulación a la baja. *La expresión de PLCD4 es un marcador de cáncer. **Los efectos de la PKC son específicos del tipo celular: en el SNC, la activación de la PKC se asoció con la excitación neuronal (5-HT) y la memoria. **A1-A10 y B2-B9 representan las distintas isoformas de las SERPIN.

Para validar a modo de ejemplo las expresiones de ARNm basadas en microarrays, se realizaron reacciones de RT-PCR en tiempo real para cinco genes, utilizando en cada caso dos pares diferentes de muestras tratadas y no tratadas. La expresión de estos genes se cuantificó y se calcularon las razones entre las muestras tratadas y no tratadas, que se compararon con las razones obtenidas en los experimentos de microarrays (Tabla 3). El coeficiente de correlación entre los valores de expresión de ARNm determinados por hibridación de microarrays y por RT-PCR en tiempo real fue R=0,81, lo que indica un alto grado de concordancia entre los resultados obtenidos por ambos métodos.

Discusión

El efecto de los adaptógenos sobre los receptores acoplados a proteínas G unidos a la membrana

Una característica común a todos los fármacos ensayados es su efecto sobre las vías de señalización de los receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Todos los adaptógenos ensayados desregularon de forma significativa la expresión de un gran número de genes que codifican (a) GPCR (Tabla 5) y (b) proteínas clave de las vías efectoras de las proteínas G, es decir, la transducción de señales mediada por AMPc, fosfolipasa C (PLC) y fosfatidilinositol (Tabla 6; Figura 3).

Los receptores acoplados a proteínas G (Gilman, 1987; Foord et al., 2005) participan en una amplia variedad de procesos fisiológicos (Wettschureck y Offermanns, 2005; Hazell et al., 2011), entre ellos: la regulación del comportamiento y del estado de ánimo, incluida la unión de neurotransmisores como la serotonina, la dopamina, el GABA y el glutamato; los sistemas nerviosos simpático y parasimpático, regulados por las vías de los GPCR y responsables del control de muchas funciones corporales automáticas, como la regulación de la presión arterial, la frecuencia cardíaca y los procesos digestivos; la regulación de la actividad del sistema inmunitario y la inflamación; y la modulación de la homeostasis neuroendocrina.

Se considera que la regulación de los GPCR desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de la homeostasis fisiológica durante el estrés (Carman y Benovic, 1998). Diversos estados patológicos se asocian con alteraciones de la actividad funcional de determinados GPCR (Lefkowitz, 1996). Los GPCR son dianas de suma importancia para la neuropsicofarmacología (Roth et al., 1998). Muchos fármacos neuropsiquiátricos se unen directamente a GPCR específicos (por ejemplo, los antipsicóticos) o afectan a los GPCR de forma indirecta al influir en la cantidad de agonista nativo disponible (por ejemplo, los antidepresivos; Von Zastrow, 2002).

La Tabla 6 muestra que los adaptógenos regularon a la baja el gen HTR1A, que codifica el GPCR 5-HT3, del que se sabe que activa una cascada intracelular de segundos mensajeros que da lugar a una neurotransmisión excitatoria o inhibitoria (Hoyer et al., 1994). La activación de los receptores de serotonina modula la liberación de muchos neurotransmisores, entre ellos el glutamato, el GABA, la dopamina, la epinefrina/norepinefrina y la acetilcolina, así como de muchas hormonas, como la oxitocina, la prolactina, la vasopresina, el cortisol, la corticotropina, la sustancia P y otras. La activación de los receptores de serotonina también influye en diversos procesos biológicos y neurológicos, como la agresividad, la ansiedad, el apetito, la cognición, el aprendizaje, la memoria, el estado de ánimo, las náuseas, el sueño y la termorregulación. Diversos agentes farmacéuticos y drogas ilícitas, incluidos muchos antidepresivos y antipsicóticos, tienen como diana los receptores de serotonina (Yakel, 2000; Kennett et al., 1997). La unión de la serotonina al receptor 5-HT3 en las células neuronales del sistema nervioso central (por ejemplo, las células del tronco encefálico) y periférico abre los canales de membrana, lo que a su vez conduce a una respuesta excitatoria y a ansiedad (Kennett et al., 1997). Así pues, la regulación a la baja observada del gen HTR1A por el tirosol (Tabla 6) concuerda con publicaciones que han demostrado los efectos antidepresivos del tirosol en ratas (Wikman y Panossian, 2004; Panossian et al., 2008) y con publicaciones recientes que muestran que los extractos de Rhodiola afectan a los receptores de serotonina (Chen et al., 2009b; Mannucci et al., 2012). También se sabe que los receptores de serotonina regulan la longevidad (Murakami y Murakami, 2008) y el envejecimiento conductual (Murakami et al., 2008) en el nematodo Caenorhabditis elegans. Esto concuerda con varias publicaciones que demuestran los efectos beneficiosos de R. rosea sobre la esperanza de vida de C. elegans y de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster (Jafari et al., 2007; Wiegant et al., 2009).

Los receptores de lisofosfolípidos acoplados a proteínas G regulan la homeostasis celular del Ca2+, la arquitectura del citoesqueleto, la proliferación y la supervivencia, la migración y la adhesión. Se han implicado en el desarrollo; en la regulación de los sistemas cardiovascular, inmunitario y nervioso; en la inflamación; en la arteriosclerosis; y en el cáncer. Los ligandos de los receptores de lisofosfolípidos se unen a sus correspondientes receptores transmembrana y los activan. Los receptores activados tienen una amplia gama de efectos celulares en función de qué ligando, receptor y tipo celular estén implicados. Los efectos primarios incluyen la inhibición de la adenilato ciclasa y la liberación de calcio del retículo endoplásmico, mientras que los efectos secundarios incluyen la prevención de la apoptosis y el aumento de la proliferación celular (Meyer zu Heringdorf y Jakobs, 2007). La regulación a la baja de los GPCR por los adaptógenos (Tabla 6) indica que el número de receptores se reduce en gran medida, lo que conduce a una transducción de señales muy atenuada a través de las proteínas G y sus efectores (Von Zastrow, 2002), lo que puede contribuir al efecto beneficioso de los adaptógenos en los trastornos relacionados con el estrés.

La expresión de los receptores acoplados a proteínas G y la transducción de señales mediada por proteínas G se ven afectadas por la edad y desempeñan un papel importante en el desarrollo de las principales patologías humanas asociadas con el envejecimiento, el cáncer, los trastornos neurodegenerativos y las enfermedades cardiovasculares (Joseph et al., 1993; Alemany et al., 2007). Esto respalda los resultados de estudios in vivo en ratas que muestran que ADAPT-232 tiene un valor potencial para el tratamiento de los trastornos del sistema de estrés relacionados con la edad y puede ser eficaz para mantener la salud en las personas mayores (Makarov et al., 2007). ADAPT-232 contrarresta efectos del envejecimiento asociados con: la desregulación de la muerte celular programada (apoptosis); la supresión del sistema inmunitario y la promoción de tumores espontáneos; la disminución de la detoxificación hepática; el mal funcionamiento del SNC (pérdida de memoria y de la capacidad de aprendizaje); y el desarrollo y la progresión de la insuficiencia cardíaca y la hipercolesterolemia.

El efecto de los adaptógenos sobre las vías de señalización de las proteínas G mediadas por AMPc

Teniendo en cuenta que los adaptógenos regularon a la baja la expresión de los genes que codifican la adenilato ciclasa y regularon al alza la expresión del gen de la fosfodiesterasa, proponemos que los adaptógenos reducen el nivel de AMPc en las células cerebrales al (a) inhibir la adenilato ciclasa (inhibiendo la síntesis de AMPc) y (b) estimular la fosfodiesterasa (estimulando la degradación del AMPc; Figura 3).

La proteína quinasa A (PKA) actúa de manera dependiente de AMPc (Walsh y Van Patten, 1994). Los niveles bajos de AMPc regulan a la baja la actividad de la PKA. La PKA tiene varias funciones celulares, entre ellas la regulación del metabolismo del glucógeno, de los azúcares y de los lípidos. Los efectos de la activación de la PKA varían según el tipo celular; por ejemplo, en los adipocitos la PKA estimula las lipasas, mientras que en los miocitos (músculo esquelético) y los hepatocitos la PKA aumenta la formación de glucosa (al estimular la glucogenólisis e inhibir la glucogénesis) y su transformación catabólica en piruvato (glucólisis). Esto proporciona energía libre en forma de ATP y NADH, que desempeñan un papel importante en la respuesta al estrés.

La regulación de los niveles de AMPc y de la actividad de la PKA es un mecanismo clave de la homeostasis energética y representa un interruptor metabólico entre el catabolismo y el anabolismo (Walsh y Van Patten, 1994; Conti, 2000; Abramovitch et al., 2004; Vandamme et al., 2012). La regulación a la baja del AMPc y de la PKA por los adaptógenos disminuye las transformaciones catabólicas inducidas por el estrés. Presumiblemente, la PKA es responsable de los efectos protectores de ahorro de energía inducidos por el estrés de los adaptógenos. Este efecto de ahorro de energía favorece las transformaciones anabólicas que consumen ATP. De hecho, la inhibición de la adenilato ciclasa por los adaptógenos puede aumentar los niveles intracelulares de ATP e impedir que el ATP se convierta en AMPc (Taussig y Gilman, 1995). Este mayor almacén de ATP podría representar una fuente de energía para otras reacciones enzimáticas dependientes de ATP necesarias para el metabolismo.

El deterioro mitocondrial es una causa importante del envejecimiento y conduce a la posterior muerte de los organismos aerobios, incluidos los seres humanos. Las alteraciones del estado antioxidante mitocondrial se asociaron invariablemente con una disminución de las capacidades mitocondriales de generación de ATP, así como con aumentos de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) de origen mitocondrial en todos los tejidos analizados.

La suplementación a largo plazo de ratones C57BL/6J machos y hembras (a partir de las 36 semanas de edad) con esquizandrina B (administrado al 0,012%, p/p) mejoró la capacidad mitocondrial de generación de ATP en varios tejidos (cerebro, corazón, hígado y riñón) durante el envejecimiento y mitigó las alteraciones dependientes de la edad en la capacidad antioxidante mitocondrial y en la capacidad funcional, retardando así el proceso de envejecimiento en los ratones, en particular durante el envejecimiento temprano, hasta las 120 semanas de edad (Ko et al., 2008). Se demostró que el esquizandrina B aumenta los niveles intracelulares de ATP y protege frente a la nefrotoxicidad inducida por gentamicina y ciclosporina A al disminuir el estrés oxidativo y la muerte celular in vitro e in vivo (Chiu et al., 2008; Zhu et al., 2012). El extracto de R. rosea activó la síntesis o resíntesis de ATP en las mitocondrias del músculo esquelético y estimuló los procesos energéticos reparadores tras un ejercicio intenso en ratas. El tratamiento con extracto de R. rosea prolongó de forma significativa (en un 24,6%) la duración de la natación hasta el agotamiento en comparación con las ratas control (Abidov et al., 2003). Se demostró que el salidrósido aumenta significativamente la tasa de ATP en queratinocitos aislados (Delepee et al., 2004). Estos estudios concuerdan con nuestra hipótesis sobre el mecanismo de generación de ATP por los adaptógenos y sus posibles beneficios en la fatiga y las enfermedades relacionadas con el envejecimiento.

Se sabe que las células de la corteza prefrontal del cerebro contienen canales activados por hiperpolarización que pueden abrirse cuando se exponen al AMPc durante el estrés. La apertura excesiva de estos canales deteriora la función cognitiva. Se ha sugerido que los inhibidores del AMPc pueden inactivar los canales y permitir el funcionamiento normal de la neurona. Esto reconecta las células hiperpolarizadas a la red neuronal y, de este modo, mejora la memoria de trabajo, que desempeña un papel clave en el pensamiento abstracto, la planificación, la organización, etc. (Wang et al., 2007; Arnsten, 2011). Los adaptógenos podrían ser útiles en terapias para los déficits cognitivos asociados con el envejecimiento normal y para los cambios cognitivos asociados con la esquizofrenia, el trastorno bipolar o el trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH; Wang et al., 2011).

Esta hipótesis concuerda con nuestros hallazgos y con publicaciones en las que ADAPT-232 y otros adaptógenos han demostrado efectos beneficiosos sobre la función cognitiva en humanos (Bogatova et al., 1997; Hartz et al., 2004; Narimanian et al., 2005; Darbinyan et al., 2007; Fintelmann y Gruenwald, 2007; Weng et al., 2007; Olsson et al., 2009; Aslanyan et al., 2010; Panossian y Wikman, 2010; Edwards et al., 2012). Dos estudios clínicos piloto mostraron que ADAPT-232 mejoró de forma significativa la atención y aumentó la velocidad y la precisión durante tareas cognitivas estresantes en comparación con un control con placebo (Aslanyan et al., 2010). ADAPT-232 redujo de forma significativa el número de errores cometidos por los sujetos de prueba en tests psicométricos complejos (Bogatova et al., 1997) y mejoró la calidad de vida y el periodo de recuperación de pacientes que padecían neumonía aguda inespecífica (Narimanian et al., 2005).

Efectos de los adaptógenos sobre las vías de señalización de las proteínas G del fosfatidilinositol y de la fosfolipasa C

Todos los adaptógenos ensayados regulan al alza el gen PLCB1, que codifica la PLC específica de fosfoinosítidos, y el gen PI3KC2G, que codifica las fosfatidilinositol 3-quinasas (PI3K; Tabla 6; Figura 3).

Cuando es activada por una proteína G, la PLC cataliza la hidrólisis del fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) en diacilglicerol (DAG) e inositol-1,4,5-trifosfato (IP3; Figura 3; Gilman, 1987). El IP3 participa en diversas vías de señalización celular asociadas con fenómenos tan dispares como la depresión y el crecimiento tumoral (Stutzmann, 2005; Sarkisov y Wang, 2008). El DAG activa la proteína quinasa C (PKC), que fosforila muchas otras proteínas (Nishizuka, 1995) y desempeña un papel importante en el crecimiento tumoral (Yamasaki et al., 2009).

La PI3K es un mediador clave situado en un punto inicial de la transducción de señales y desempeña un papel importante en la regulación de las respuestas de defensa mediadas por NF-κB, así como en la apoptosis. La PI3K es necesaria para la potenciación a largo plazo de la transmisión de señales entre neuronas, que se asocia con el reforzamiento de la memoria y del aprendizaje (Opazo et al., 2003; Karpova et al., 2006; Yang et al., 2008).

Efectos comunes sobre la expresión de genes implicados en la regulación de proteínas citoplasmáticas y nucleares

ADAPT-232 reguló al alza el gen SERPINI1 (inhibidor de la peptidasa serpina, neuroserpina), que participa en el desarrollo y la función del sistema nervioso (Teesalu et al., 2004; Yepes y Lawrence, 2004). La neuroserpina controla el crecimiento axonal y, de ese modo, favorece la transmisión de los impulsos nerviosos. Desempeña un papel importante en el desarrollo de las sinapsis y regula la plasticidad sináptica, lo que sugiere que podría ser importante para el aprendizaje y la memoria (Hastings et al., 1997; Davis et al., 1999; Kinghorn et al., 2006). Además, la neuroserpina inhibe la actividad del activador tisular del plasminógeno (tPA), que interviene en la migración celular, la coagulación sanguínea y la inflamación (Yepes y Lawrence, 2004).

Una característica común a todos los adaptógenos ensayados fue la regulación a la baja del gen CETP, que codifica la proteína de transferencia de ésteres de colesterol, una proteína lipídica plasmática que facilita el transporte de ésteres de colesterol y de triglicéridos entre las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y las lipoproteínas de alta densidad (HDL; Bruce et al., 1998). La inhibición farmacológica de la CETP alivió la aterosclerosis y otras enfermedades cardiovasculares, así como el síndrome metabólico (Barter et al., 2003).

Los adaptógenos regularon a la baja el gen ESR1 (Tabla 6). ESR1 codifica el receptor de estrógenos alfa (ER), un receptor nuclear que pertenece a una gran familia de factores de transcripción, que transduce señales hormonales y regula la expresión de genes diana (Evans, 1988). El ER se localiza principalmente en el citoplasma (Welshons et al., 1984) en complejos con proteínas de choque térmico (hsp90, hsp70 y hsp56) en una forma transcripcionalmente inactiva (Pratt, 1992). Los ER se expresan en diversos tejidos, como la mama, los ovarios, los testículos, el pulmón, el útero, el hueso, el hígado y el cerebro. En el prosencéfalo humano, los ER se localizan predominantemente en la amígdala (que se ha propuesto que interviene en el estado de ánimo y la cognición), el hipotálamo (implicado en el aprendizaje y la memoria) y el septo (Österlund y Hurd, 2001; Yaghmaie et al., 2005; Dahlman-Wright et al., 2006). Los trastornos afectivos del estado de ánimo, como el síndrome premenstrual, la depresión posparto y la depresión posmenopáusica, se asocian con niveles séricos bajos de estrógenos. Se ha demostrado que el tratamiento con estradiol regula a la baja el ER en el útero y en varias áreas cerebrales (Shupnik et al., 1989; Lauber et al., 1990, 1991; Simerly y Young, 1991; Österlund et al., 1998).

La expresión de ESR1 es específica de tejido y está regulada de forma diferencial y específica de región en el cerebro. Se ha demostrado que la señalización de estrógenos a través del ER puede atenuar de forma significativa un proceso neurodegenerativo inflamatorio al actuar a través de los astrocitos. La expresión del ER es necesaria en los astrocitos, pero no en las neuronas, para la neuroprotección en la encefalomielitis autoinmune experimental, el modelo murino de esclerosis múltiple más utilizado, una enfermedad autoinmune caracterizada por la desmielinización y la degeneración axonal (Spencea et al., 2011). En consecuencia, cabría esperar que el efecto neuroprotector de los adaptógenos (Kim et al., 2004; Bu et al., 2005; Chen et al., 2009a; Qu et al., 2009; Bocharov et al., 2010; Zhang et al., 2007, 2010; Li et al., 2011; Lee et al., 2012a,b; Palumbo et al., 2012; Shi et al., 2012; Zeng et al., 2012) esté asociado con una regulación al alza de ESR1 en las células gliales. Sorprendentemente, los resultados de nuestro estudio no concuerdan con esta previsión, porque los adaptógenos regulan a la baja la expresión del gen del ER. ¿Cómo interpretar estas observaciones contradictorias, la neuroprotección acompañada de una regulación a la baja de la expresión del gen del ER? Este caso es similar a otro, cuando se esperaba que los adaptógenos protectores frente al estrés tuvieran que reducir el cortisol, porque normalmente el cortisol aumenta durante el estrés. En efecto, los adaptógenos reducen el cortisol en el estrés (Panossian et al., 1999b). Sin embargo, los adaptógenos pueden aumentar la secreción de cortisol/corticosterona cuando se añaden a células adrenocorticales aisladas (Panossian et al., 1999b; Panossian et al., 2007). La respuesta celular (secreción de cortisol/corticosterona) a los adaptógenos y al estrés es similar, una activación, leve con los adaptógenos y mucho más intensa en el estrés. Sin embargo, la respuesta al estrés (secreción de cortisol/corticosterona) fue significativamente menor en las células pretratadas con adaptógenos que en las células control (Panossian et al., 1999b; Panossian et al., 2007). El pretratamiento con adaptógeno, la denominada «respuesta adaptativa al estrés» o «preacondicionamiento» u «hormesis» (Mattson et al., 2007), que actúa como un estrés leve o «vacuna de estrés», adapta la célula al estrés (Panossian et al., 1999b; Wiegant et al., 2008; Boon-Niermeijer et al., 2012). De forma análoga, cabe especular que la regulación a la baja de la expresión del gen del ER por los adaptógenos es una señal para que la célula glial inicie una regulación por retroalimentación del ER. En un sentido más amplio, este concepto se relaciona con la inflamación, que es una respuesta de defensa (sistema de defensa «encendido») para hacer frente a la infección. Para evitar una reacción exagerada, se activa un mecanismo de regulación por retroalimentación de la inflamación; por ejemplo, aumentan el cortisol y las citoquinas antiinflamatorias (sistema de defensa «apagado»). El estrés leve, en general, es una respuesta de defensa para activar la inmunidad innata. En este contexto, los adaptógenos son sustancias naturales que inician la activación de los sistemas de defensa innatos, incluido el ER como uno de los componentes del sistema de estrés.

Además del modelo «clásico» de la función de los receptores de esteroides, en el que el receptor de estrógenos unido a su ligando regula la transcripción de genes diana en el núcleo al unirse a las secuencias reguladoras de los elementos de respuesta a estrógenos de los genes diana, el receptor unido a la membrana activado por estrógenos inicia en los astrocitos vías rápidas de señalización PI3K/PLC para modular indirectamente la función y la supervivencia neuronales (Deroo y Korach, 2006; Mhyre et al., 2006). El tratamiento con estrógenos atenúa la transcripción «no clásica» en los sitios de los elementos de respuesta a estrógenos en las células de glioma (Mhyre et al., 2006). Los adaptógenos regulan al alza PLCB1, PI3KC2G y genes relacionados con el AMPc, y modulan el NO y las SAPK. Estas similitudes entre los estrógenos y los adaptógenos permiten sugerir que sus mecanismos de acción interfieren de alguna manera. Si compiten como miméticos o como antagonistas sigue sin estar claro, aunque ambos son neuroprotectores. Es necesario un estudio adicional para dilucidar este mecanismo de acción de los adaptógenos.

Los ER están sobreexpresados en alrededor del 70% de los cánceres de mama (Deroo y Korach, 2006). La regulación farmacológica a la baja de ESR1 podría ser eficaz en el tratamiento y la prevención del cáncer de mama, el cáncer de ovario, el cáncer de colon, el cáncer de próstata y el cáncer de endometrio (Fabian y Kimler, 2005; Ascenzi et al., 2006).

Además, algunas de las muestras ensayadas regularon a la baja el gen OLFM4, del que se informó recientemente que inhibe las vías apoptóticas y promueve la proliferación de las células tumorales. Esto sugiere que OLFM4 podría servir como marcador diagnóstico de los cánceres humanos (Koshida et al., 2007; Oh et al., 2011). La expresión reducida del gen OLFM4 inhibe el crecimiento celular y aumenta la sensibilización a la apoptosis inducida por el peróxido de hidrógeno y por el factor de necrosis tumoral alfa en células de cáncer gástrico (Liu et al., 2012). La regulación a la baja del gen PLCD4 (Tabla 6), que codifica la PLC citoplasmática, parece estar asociada con la actividad catabólica de los adaptógenos.

El concepto de sinergia/antagonismo y consideraciones sobre la dependencia dosis-efecto

El mecanismo de acción de los adaptógenos en las células T98G se asoció con la desregulación de numerosos genes. Incluso un único compuesto purificado de los extractos, por ejemplo el salidrósido, el triandrina o el tirosol de la Rhodiola, el esquizandrina B de la Schisandra o el eleuterósido E del Eleutherococcus, afectó a la actividad de 500 a 700 genes pertenecientes a varias redes funcionales distintas.

El número aproximado de genes afectados por cualquier compuesto individual de ADAPT-232 fue del mismo orden que el número de genes afectados por la mezcla completa. Aunque el perfil de expresión génica contuviera los mismos genes (Figura 2), su expresión se mantiene en la misma magnitud (el mismo rango de cambios en veces, Tablas 5 y 6 y Material complementario). El número total de interacciones en las redes moleculares no aumentó de forma proporcional al número de compuestos activos de la mezcla. Es más, el número de genes diana afectados por la mezcla compleja disminuyó en algunas vías en comparación con los compuestos individuales. La Figura 2 muestra que 735 genes desregulados se solapan entre los compuestos de un solo componente. Sin embargo, no explican la totalidad de los 1056 genes afectados por ADAPT-232, lo que sugiere que la desregulación de 321 genes por ADAPT-232 se debe a interacciones sinérgicas. Así pues, es posible que algunos de los efectos farmacológicos de ADAPT-232 estén asociados con estos 321 genes, lo que respalda el concepto de sinergia para las mezclas herbarias. Por otro lado, el conjunto completo de todos los genes desregulados por los tres extractos individuales es de 2188, mientras que ADAPT-232 desregula solo 1056 genes. Esto indica que las interacciones antagónicas de los tres componentes de la mezcla pueden dar lugar a la supresión de algunos efectos (posiblemente negativos) de los fármacos individuales en la combinación fija de ADAPT-232. Esto también concuerda con el concepto de sinergia/antagonismo para las mezclas herbarias.

Las sustancias individuales purificadas revelaron una regulación diferencial de más genes que los extractos; por ejemplo, el extracto de Rhodiola afectó a más genes que el salidrósido, el tirosol o el triandrina, y ADAPT-232 afectó a más genes que los extractos de Rhodiola, Schisandra o Eleutherococcus (Tablas 5 y 6).

Por ejemplo, el esquizandrina B a una concentración de 3 µM reguló a la baja de forma significativa una serie de genes (hasta 12854 veces, Tabla 7) que no se veían afectados en el extracto total (en el que la concentración de esquizandrina era comparable). Además, los perfiles de expresión génica del esquizandrina B y del extracto de Schisandra fueron bastante diferentes (Tabla 7). Lo mismo ocurre con otros compuestos, como se muestra en las Tablas 6 a 8. Estos datos podrían respaldar el concepto reduccionista del descubrimiento de fármacos, común en la «medicina occidental», que se basa en el aislamiento y la aplicación de constituyentes activos en lugar del uso de extractos vegetales complejos.

*Ku70 es una proteína que, en los seres humanos, está codificada por el gen XRCC6, que participa en la reparación del ADN y en la remodelación de la cromatina. Es posible que XRCC6 intervenga en el envejecimiento, aunque se necesitan más resultados para determinar si desempeña este papel en los seres humanos. «Entrez Gene: XRCC6 X-ray repair complementing defective repair in Chinese hamster cells 6 (Ku autoantigen, 70kDa).»

La dosis a la que se administraron los compuestos influyó fuertemente tanto en la intensidad de la respuesta celular como en el perfil de los genes expresados de forma diferencial. Por ejemplo, ADAPT-232 forte tomado a dos concentraciones diferentes (3 y 300 mg/L) dio lugar a perfiles de expresión génica bastante distintos, incluidos algunos casos de efectos de inversión dependientes de la dosis sobre un mismo gen, por ejemplo, el gen que codifica la adenilato ciclasa (Tabla 8).

Puede concluirse que la sensibilidad/reactividad celular disminuye a dosis más altas de adaptógenos, lo que dio lugar a una mayor tolerancia celular frente a otros factores de estrés. Algunos efectos de los ingredientes individuales sobre la expresión génica se neutralizaron cuando los ingredientes se combinaron en mezclas. En general, en las mezclas complejas solo se observaron los efectos más comunes atribuidos a los ingredientes individuales. Curiosamente, en lugar de potenciar los niveles de expresión génica, la combinación de estos componentes produjo una especie de «efecto de suavizado» sobre el nivel de expresión génica.

Evidentemente, deben tenerse en cuenta las limitaciones de cualquier experimento con modelos celulares in vitro cuando se generalizan las conclusiones. Los cambios en el perfil génico de cualquier línea celular aislada no pueden reflejar todos los que se producen en el organismo completo, debido a las numerosas interacciones con las hormonas circulantes y con los mediadores del sistema inmunitario. No obstante, estos experimentos in vitro pueden ser útiles para hallar posibles mecanismos clave de acción de los adaptógenos, en particular cuando se consideran en el contexto del enorme gran volumen de datos obtenidas en estudios clínicos y preclínicos. Es solo el primer paso para definir una hipótesis realista. Los estudios posteriores pueden centrarse en las evidencias que respalden esta hipótesis. No se descarta que los extractos vegetales se metabolicen en el hígado y que, por tanto, sus metabolitos también puedan competir con los precursores. Sin embargo, la relevancia de este modelo in vitro para los resultados de los estudios clínicos se ve respaldada por los estudios farmacocinéticos del salidrósido, el tirosol, el eleuterósido E y el esquizandrina. La semivida (t1/2) fue de 4,662 h para el eleuterósido E (Feng et al., 2006), 4,5 h para el salidrósido en el extracto SHR-5 (Panossian et al., 2010), 2 h para el tirosol (Panossian et al., 2009) y 4,6 h para el esquizandrina (Wang et al., 2008). La curva farmacocinética del esquizandrina tiene tres máximos de concentración en sangre a las 1, 3 y 8 h, y sigue siendo detectable en sangre durante al menos 20 h (Wang et al., 2008; Liang et al., 2010). Eso es suficiente para llegar al cerebro desde el torrente sanguíneo, atravesar la barrera hematoencefálica e interactuar con las membranas de las células gliales, donde se localizan los receptores de proteínas G. En conclusión, los efectos de los adaptógenos sobre los perfiles de expresión génica en las células neurogliales afectaron principalmente al metabolismo energético (efectos anabólicos) y a las funciones del SNC. Estos resultados pueden conciliarse con los efectos beneficiosos de los adaptógenos en trastornos conductuales, mentales y relacionados con el envejecimiento.

Concluimos también que la mezcla de dos o más sustancias activas en una sola combinación modifica de forma significativa los perfiles de genes desregulados: las interacciones sinérgicas dan lugar a la activación de genes que ninguna de las sustancias individuales afectaba, mientras que las interacciones antagónicas dan lugar a la supresión de algunos genes activados por las sustancias individuales. En consecuencia, estos cambios pueden influir en el control transcripcional de la regulación metabólica, tanto a nivel celular como a nivel del organismo completo. Como resultado, el perfil farmacológico de la combinación puede diferir de los perfiles de los ingredientes. De igual modo, los perfiles farmacológicos de los compuestos purificados podrían diferir del perfil farmacológico del extracto vegetal total. Presumiblemente, este fenómeno podría aprovecharse para eliminar efectos indeseables (por ejemplo, efectos tóxicos) y aumentar la selectividad de la intervención farmacológica.

Declaración de conflicto de intereses

Rebecca Hamm, Thomas Efferth y Alexander Panossian declaran no tener intereses financieros en conflicto. Georg Wikman es accionista del Swedish Herbal Institute (SHI).

Material complementario

Referencias

1. AbidovM.CrendalF.GrachevS.SeifullaR.ZiegenfussT. (2003). Effect of extracts from Rhodiola rosea and Rhodiola crenulata (Crassulaceae) roots on ATP content in mitochondria of skeletal muscles. Bull. Exp. Biol. Med. 136, 585-58710.1023/B:BEBM. 0000020211.24779.1515500079
2. AbramovitchR.TavorE.Jacob-HirschJ.ZeiraE.AmariglioN.PappoO. (2004). A pivotal role of cyclic AMP-responsive element binding protein in tumor progression. Cancer Res. 64, 1338-134610.1158/0008-5472.CAN-03-208914973073
3. AlemanyR.PeronaJ. S.Snchez-DominguezJ. M.MonteroE.CaizaresJ.BressaniR. (2007). G protein-coupled receptor systems and their lipid environment in health disorders during aging. Biochim. Biophys. Acta 1768, 964-97510.1016/j.bbamem.2006.09.02417070497
4. ArnstenA. F. (2011). Prefrontal cortical network connections: key site of vulnerability in stress and schizophrenia. Int. J. Dev. Neurosci. 29, 215-22310.1016/j.ijdevneu.2011.02.00621345366PMC3115784
5. AscenziP.BocediA.MarinoM. (2006). Structure-function relationship of estrogen receptor alpha and beta: impact on human health. Mol. Aspects Med. 27, 299-40210.1016/j.mam.2006.07.00116914190
6. AslanyanG.AmroyanE.GabrielyanE.PanossianA.WikmanG. (2010). Double-blind, placebo-controlled, randomised study of the single dose effects of ADAPT-232 on cognitive functions. Phytomedicine 17, 494-49910.1016/j.phymed.2010.02.00520374974
7. BarterP. J.BrewerH. B.Jr.ChapmanM. J.HennekensC. H.RaderD. J.TallA. R. (2003). Cholesteryl ester transfer protein: a novel target for raising HDL and inhibiting atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 23, 160-16710.1161/01.ATV. 0000054658.91146.6412588754
8. BennettG. W. (2000). "Glia or neuroglia," in Encyclopedia of Stress, Vol. 2, ed. FinkG. (San Diego: Academic Press), 218-223
9. BleakneyT. L. (2008). Deconstructing an adaptogen: Eleutherococcus senticosus. Holist. Nurs. Pract. 22, 220- 2241860723510.1097/01.HNP.0000326005.65310.7c
10. BocharovE. V.Ivanova-SmolenskayaI. A.PoleshchukV. V.KucheryanuV. G.Il'enkoV. A.BocharovaO. A. (2010). Therapeutic efficacy of the neuroprotective plant adaptogen in neurodegenerative disease (Parkinson's disease as an example). Bull. Exp. Biol. Med. 149, 682- 68410.1007/s10517-010-1023-z21165417
11. BogatovaR.ShlyakovaL.SalnitskyV.WikmanG. (1997). Evaluation of the effect of single take of a phyto adaptogen on human subject work ability during long isolation. Aero. Environ. Med. 31, 51-549424198
12. Boon-NiermeijerE. K.van den BergA.VorontsovaO. N.BaydaL. A.MalyshevI. Yu.WiegantF. A. C. (2012). Enhancement of adaptive resistance against a variety of chronic stress conditions by plant adaptogens: protective effects on survival and embryonic development of Lymnaea stagnalis. Adapt. Med. 4, 233-244
13. BrekhmanIIDardymovI. V. (1969). New substances of plant origin which increase nonspecific resistance. Annu. Rev. Pharmacol. 9, 419-43010.1146/annurev.pa.09.040169.0022234892434
14. BruceC.SharpD. S.TallA. R. (1998). Relationship of HDL and coronary heart disease to a common amino acid polymorphism in the cholesteryl ester transfer protein in men with and without hypertriglyceridemia. J. Lipid Res. 39, 1071-10789610775
15. BuY.JinZ. H.ParkS. Y.BaekS.RhoS.HaN. (2005). Siberian ginseng reduces infarct volume in transient focal cerebral ischaemia in Sprague-Dawley rats. Phytother. Res. 19, 167-16910.1002/ptr.164915852490
16. CarmanC. V.BenovicJ. L. (1998). G-protein-coupled receptors: turn-ons and turn-offs. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 335-34410.1016/ S0959-4388(98)80058-59687355
17. ChanS. W. (2012). Panax ginseng, Rhodiola rosea and Schisandra chinensis. Int. J. Food Sci. Nutr. 63(Suppl. 1), 75- 8110.3109/09637486.2011.62784022039930
18. ChenX.ZhangQ.ChengQ.DingF. (2009a). Protective effect of salidroside against H2O2-induced cell apoptosis in primary culture of rat hippocampal neurons. Mol. Cell. Biochem. 332, 85-9310.1007/s11010-009-0177-319554425
19. ChenQ. G.ZengY. S.QuZ. Q.TangJ. Y.QinY. J.ChungP. (2009b). The effects of Rhodiola rosea extract on 5-HT level, cell proliferation and quantity of neurons at cerebral hippocampus of depressive rats. Phytomedicine 16, 830-83810.1016/j.phymed. 2008.07.00319403286
20. ChiuP. Y.LeungH. Y.KoK. M. (2008). Schisandrin B enhances renal mitochondrial antioxidant status, functional and structural integrity, and protects against gentamicin-induced nephrotoxicity in rats. Biol. Pharm. Bull. 31, 602-60510.1248/bpb.31.60218379049
21. ContiM. (2000). Phosphodiesterases and cyclic nucleotide signaling in endocrine cells. Mol. Endocrinol. 14, 1317-132710.1210/me. 14.9.131710976911
22. Dahlman-WrightK.CavaillesV.FuquaS. A.JordanV. C.KatzenellenbogenJ. A.KorachK. S. (2006). International Union of Pharmacology. LXIV. Estrogen receptors. Pharmacol. Rev. 58, 773-78110.1124/pr.58.4.817132854
23. DarbinyanV.AslanyanG.AmroyanE.GabrielyanE.MalmstromC.PanossianA. (2007). Clinical trial of Rhodiola rosea L. extract SHR-5 in the treatment of mild to moderate depression. Nord. J. Psychiatry 61, 343-34810.1080/0803948070164329017990195
24. DavisR. L.ShrimptonA. E.HolohanP. D.BradshawC.FeiglinD.CollinsG. H. (1999). Familial dementia caused by polymerization of mutant neuroserpin. Nature 401, 376-37910.1038/4389710517635
25. DavydovM.KrikorianA. D. (2000). Eleutherococcus senticosus (Rupr. & Maxim.) Maxim. (Araliaceae) as an adaptogen: a closer look. J. Ethnopharmacol. 72, 345-39310.1016/S0378-8741(00)00181-110996277
26. DelepeeR.Berteina-RabionS.LamyC.DarnaultS.RenimelI.AboutN. (2004). "Salidroside, a pharmacologically active phenolic compound: from the synthesis of the molecule to the assessment of its biological properties," in XXII International Conference on Polyphenols, Helsinski
27. DerooB. J.KorachK. S. (2006). Estrogen receptors and human disease. J. Clin. Invest. 116, 561-56710.1172/ JCI2798716511588PMC2373424
28. DwyerA. V.WhittenD. L.HawrelakJ. A. (2011). Herbal medicines, other than St. John's Wort, in the treatment of depression: a systematic review. Altern. Med. Rev. 16, 40-4921438645
29. EdwardsD.HeufelderA.ZimmermannA. (2012). Therapeutic effects and safety of Rhodiola rosea extract WS 1375 in subjects with life-stress symptoms-results of an open-label study. Phytother. Res. 26, 1220-122510.1002/ptr.371222228617
30. EMEA/HMPC/102655/. (2007). Reflection Paper on the Adaptogenic Concept. London: European Medicines Agency
31. EvansR. M. (1988). The steroid and thyroid hormone receptor superfamily. Science 240, 889-89510.1126/science. 28369513283939PMC6159881
32. FabianC. J.KimlerB. F. (2005). Selective estrogen-receptor modulators for primary prevention of breast cancer. J. Clin. Oncol. 23, 1644-165510.1200/JCO.2005.11.00515755972
33. FengS.HuF.ZhaoJ. X.LiuX.LiY. (2006). Determination of eleutheroside E and eleutheroside B in rat plasma and tissue by high- performance liquid chromatography using solid-phase extraction and photodiode array detection. Eur. J. Pharm. Biopharm. 62, 315- 32010.1016/j.ejpb.2005.09.00716318914
34. FinkG. (2000). Encyclopedia of Stress, Vol. I San Diego: Academic Press, 760
35. FintelmannV.GruenwaldJ. (2007). Efficacy and tolerability of a Rhodiola rosea extract in adults with physical and cognitive deficiencies. Adv. Ther. 24, 929-93910.1007/BF0284998617901042
36. FoordS. M.BonnerT. I.NeubigR. R.RosserE. M.PinJ. P.DavenportA. P. (2005). International Union of Pharmacology. XLVI. G protein- coupled receptor list. Pharmacol. Rev. 57, 279-28810.1124/pr.57.2.515914470
37. GilmanA. G. (1987). G proteins: transducers of receptor-generated signals. Annu. Rev. Biochem. 56, 615-64910.1146/annurev.bi. 56.070187.0031513113327
38. GouletE. D.DionneI. J. (2005). Assessment of the effects of eleutherococcus senticosus on endurance performance. Int. J. Sport Nutr. Exerc. Metab. 15, 75-831590299110.1123/ijsnem.15.1.75
39. GuzhovaI.KislyakovaK.MoskaliovaO.FridlanskayaI.TytellM.CheethamM. (2001). In vitro studies show that Hsp70 can be released by glia and that exogenous Hsp70 can enhance neuronal stress tolerance. Brain Res. 914, 66-7310.1016/S0006-8993(01)02774-311578598
40. HartzA. J.BentlerS.NoyesR.HoehnsJ.LogemannC.SiniftS. (2004). Randomized controlled trial of Siberian ginseng for chronic fatigue. Psychol. Med. 34, 51-5610.1017/S003329170300879114971626
41. HastingsG. A.ColemanT. A.HaudenschildC. C.StefanssonS.SmithE. P.BarthlowR. (1997). Neuroserpin, a brain-associated inhibitor of tissue plasminogen activator is localized primarily in neurons. Implications for the regulation of motor learning and neuronal survival. J. Biol. Chem. 272, 33062-3306710.1074/jbc.272.52.330629407089
42. HauwelM.FuronE.CanovaC.GriffithsM.NealJ.GasqueP. (2005). Innate (inherent) control of brain infection, brain inflammation and brain repair: the role of microglia, astrocytes, "protective" glial stem cells and stromal ependymal cells. Brain Res. Rev. 48, 220- 22310.1016/j.brainresrev.2004.12.01715850661
43. HaydonP. G. (2001). Glia: listening and talking to the synapse. Nat. Rev. Neurosci. 2, 185-19310.1038/3505852811256079
44. HazellG. G.HindmarchC. C.PopeG. R.RoperJ. A.LightmanS. L.MurphyD. (2011). G protein-coupled receptors in the hypothalamic paraventricular and supraoptic nuclei - serpentine gateways to neuroendocrine homeostasis. Front. Neuroendocrinol. 33, 45-6610.1016/ j.yfrne.2011.07.00221802439PMC3336209
45. HennF. A.HambergerA. (1971). Glial cell function: uptake of transmitter substances. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 68, 2686- 269010.1073/pnas.68.11.26864330937PMC389501
46. HoyerD.ClarkeD. E.FozardJ. R.HartigP. R.MartinG. R.MylecharaneE. J. (1994). International Union of Pharmacology classification of receptors for 5-hydroxytryptamine (Serotonin). Pharmacol. Rev. 46, 157-2037938165
47. HuangL.ZhaoH.HuangB.ZhengC.PengW.QinL. (2011). Acanthopanax senticosus: review of botany, chemistry and pharmacology. Pharmazie 66, 83-9721434569
48. HungS. K.PerryR.ErnstE. (2011). The effectiveness and efficacy of Rhodiola rosea L.: a systematic review of randomized clinical trials. Phytomedicine 18, 235-24410.1016/j.phymed.2010.08.01421036578
49. IovienoN.DaltonE. D.FavaM.MischoulonD. (2011). Second-tier natural antidepressants: review and critique. J. Affect. Disord. 130, 343-35710.1016/j.jad.2010.06.01020579741
50. IshaqueS.ShamseerL.BukutuC.VohraS. (2012). Rhodiola rosea for physical and mental fatigue: a systematic review. BMC Complement. Altern. Med. 12:7010.1186/1472-6882-12-7022643043PMC3541197
51. JafariM.FelgnerJ. S.BusselI. I.HutchiliT.KhodayariB.RoseM. R. (2007). Rhodiola: a promising anti-aging Chinese herb. Rejuvenation Res. 10, 587-60210.1089/rej.2007.056017990971
52. JosephJ. A.CutlerR.RothG. S. (1993). Changes in G protein-mediated signal transduction in aging and Alzheimer's disease, Ann. N. Y. Acad. Sci. 695, 42-4510.1111/j.1749-6632.1993.tb23024.x8239310
53. KarpovaA.SannaP. P.BehnischT. (2006). Involvement of multiple phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathways in the persistence of late-phase long term potentiation expression. Neuroscience 137, 833-84110.1016/j.neuroscience.2005.10.01216326012
54. KennettG. A.BrightF.TrailB.BlackburnT. P.SangerG. J. (1997). Anxiolytic-like actions of the selective 5-HT4 receptor antagonists SB 204070A and SB 207266A in rats. Neuropharmacology 36, 707-71210.1016/S0028-3908(97)00037-39225297
55. KimS. R.LeeM. K.KooK. A.KimS. H.SungS. H.LeeN. G. (2004). Dibenzocyclooctadiene lignans from Schisandra chinensis protect primary cultures of rat cortical cells from glutamate-induced toxicity. J. Neurosci. Res. 76, 397-40510.1002/jnr.2008915079869
56. KinghornK. J.CrowtherD. C.SharpL. K.NereliusC.DavisR. L.ChangH. T. (2006). Neuroserpin binds Abeta and is a neuroprotective component of amyloid plaques in Alzheimer disease. J. Biol. Chem. 281, 29268-2927710.1074/jbc.M60069020016849336
57. KoK. M.ChenN.LeungH. Y.LeongE. P.PoonM. K.ChiuP. Y. (2008). Long-term schisandrin B treatment mitigates age-related impairments in mitochondrial antioxidant status and functional ability in various tissues, and improves the survival of aging C57BL/6J mice. Biofactors 34, 331-34210.1002/biof.552034040819850987
58. KoshidaS.KobayashiD.MoriaiR.TsujiN.WatanabeN. (2007). Specific overexpression of OLFM4GW112/hGC-1 mRNA in colon, breast and lung cancer tissues detected using quantitative analysis. Cancer Sci. 98, 315-32010.1111/j. 1349-7006.2006.00383.x17270020PMC11159027
59. LauberA. H.MobbsC. V.MuramatsuM.PfaffD. W. (1991). Estrogen receptor messenger RNA expression in rat hypothalamus as a function of genetic sex and estrogen dose. Endocrinology 129, 3180-318610.1210/endo-129-6-31801954897
60. LauberA. H.RomanoG. J.MobbsC. V.PfaffD. W. (1990). Estradiol regulation of estrogen receptor messenger ribonucleic acid in rat mediobasal hypothalamus: an in situ hybridization study. J. Neuroendocrinol. 2, 605-61110.1111/j.1365-2826.1990.tb00454.x19215395
61. LazarevN. V. (1958). General and specific in action of pharmacological agents. Arch. Farmacol. Toxicol. 2, 81-86
62. LazarevN. V.LjublinaE. I.RozinM. A. (1959). State of nonspecific resistance. Patol. Fiziol. Experim. Terapia. 3, 16-2114414794
63. LeeD.ParkJ.YoonJ.KimM. Y.ChoiH. Y.KimH. (2012a). Neuroprotective effects of Eleutherococcus senticosus bark on transient global cerebral ischemia in rats. J. Ethnopharmacol. 139, 6-1110.1016/j.jep.2011.11.04921645606
64. LeeT. H.JungC. H.LeeD. H. (2012b). Neuroprotective effects of Schisandrin B against transient focal cerebral ischemia in Sprague- Dawley rats. Food Chem. Toxicol. 50, 4239-424510.1016/j.fct.2012.08.04722960133
65. LefkowitzR. J. (1996). G protein-coupled receptors and receptor kinases: from molecular biology to potential therapeutic applications. Nat. Biotechnol. 14, 283-28610.1038/nbt0396-2839630887
66. LiX.YeX.LiX.SunX.LiangQ.TaoL. (2011). Salidroside protects against MPP(+)-induced apoptosis in PC12 cells by inhibiting the NO pathway. Brain Res. 1382, 9-1810.1016/j.brainres.2011.07.02821241673
67. LiangY.HaoH.KangA.XieL.XieT.ZhengX. (2010). Qualitative and quantitative determination of complicated herbal components by liquid chromatography hybrid ion trap time-of-flight mass spectrometry and a relative exposure approach to herbal pharmacokinetics independent of standards. J. Chromatogr. A 1217, 4971-497910.1016/j.chroma.2010.05.05620630198
68. LiuR. H.YangM. H.XiangH.BaoL. M.YangH. A.YueL. W. (2012). Depletion of OLFM4 gene inhibits cell growth and increases sensitization to hydrogen peroxide and tumor necrosis factor-alpha induced-apoptosis in gastric cancer cells. J. Biomed. Sci. 19, 38- 4810.1186/1423-0127-19-5322471589PMC3359197
69. MakarovV. G.MakarovaM. N.StolaschyckN. V.WikmanG.PanossianA. (2007). Potential use of plant adaptogen in age related disorders, celebration of the centennial birth of Hans Selye, Budapest, Hungary. Cell Stress Chaperones 242
70. MannucciC.NavarraM.CalzavaraE.CaputiA. P.CalapaiG. (2012). Serotonin involvement in Rhodiola rosea attenuation of nicotine withdrawal signs in rats. Phytomedicine 19, 1117-112410.1016/j.phymed.2012.07.00122921986
71. MattsonM. P.SonT. G.CamandolaS. (2007). Viewpoint: mechanisms of action and therapeutic potential of neurohormetic phytochemicals. Dose Response 5, 174-18610.2203/dose-response.07-004.Mattson18648607PMC2477698
72. Meyer zu HeringdorfD.JakobsK. H. (2007). Lysophospholipid receptors: signalling, pharmacology and regulation by lysophospholipid metabolism. Biochim. Biophys. Acta 1768, 923-94010.1016/j.bbamem.2006.09.02617078925
73. MhyreA. J.ShapiroR. A.DorsaD. M. (2006). Estradiol reduces nonclassical transcription at cyclic adenosine 3,5-monophosphate response elements in glioma cells expressing estrogen receptor alpha. Endocrinology 147, 1796-180410.1210/en.2005-131616439453
74. MurakamiH.BessingerK.HellmannJ.MurakamiS. (2008). Manipulation of serotonin signal suppresses early phase of behavioral aging in Caenorhabditis elegans. Neurobiol. Aging 29, 1093-110010.1016/j.neurobiolaging.2007.01.01317336425
75. MurakamiH.MurakamiS. (2008). Serotonin receptors antagonistically modulate Caenorhabditis elegans longevity. Aging Cell 6, 483- 48810.1111/j.1474-9726.2007.00303.x17559503
76. NarimanianM.BadalyanM.PanosyanV.GabrielyanE.PanossianA.WikmanG. (2005). Impact of Chisan (ADAPT-232) on the quality-of- life and its efficacy as an adjuvant in the treatment of acute non-specific pneumonia. Phytomedicine 12, 723-72910.1016/j.phymed. 2004.10.00116323290
77. NguyenM. D.JulienJ.-P.RivestS. (2002). Innate immunity: the missing link in neuroprotection and neurodegeneration? Nat. Rev. Neurosci. 3, 216-22710.1038/nrn75211994753
78. NishizukaY. (1995). Protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses. FASEB J. 9, 484-4967737456
79. OhH. K.TanA. L.DasK.OoiC. H.DengN. T.TanI. B. (2011). Genomic loss of miR-486 regulates tumor progression and the OLFM4 antiapoptotic factor in gastric cancer. Clin. Cancer Res. 17, 2657-266710.1158/1078-0432.CCR-10-315221415212
80. OlssonE. M.von ScheeleB.PanossianA. G. (2009). A randomised, double-blind, placebo-controlled, parallel-group study of the standardised extract shr-5 of the roots of Rhodiola rosea in the treatment of subjects with stress-related fatigue. Planta Med. 75, 105- 11210.1055/s-0029-123500619016404
81. OpazoP.WatabeA. M.GrantS. G.O'DellT. J. (2003). Phosphatidylinositol 3-kinase regulates the induction of long-term potentiation through extracellular signal-related kinase-independent mechanisms. J. Neurosci. 23, 3679-36881273633910.1523/JNEUROSCI. 23-09-03679.2003PMC6742185
82. ÖsterlundM.KuiperG. G. J. M.GustafssonJ.-A.HurdY. L. (1998). Differential distribution and regulation of estrogen receptor- alpha and -beta mRNA within the female rat brain. Brain Res. Mol. Brain Res. 54, 175-18010.1016/S0169-328X(97)00351-39526077
83. ÖsterlundM. K.HurdY. L. (2001). Estrogen receptors in the human forebrain and the relation to neuropsychiatric disorders. Prog. Neurobiol. 64, 251-26710.1016/S0301-0082(00)00059-911240308
84. PalumboD. R.OcchiutoF.SpadaroF.CircostaC. (2012). Rhodiola rosea extract protects human cortical neurons against glutamate and hydrogen peroxide-induced cell death through reduction in the accumulation of intracellular calcium. Phytother. Res. 26, 878- 88310.1002/ptr.366222086763
85. PanossianA. (2003). Adaptogens: tonic herbs for fatigue and stress. Alternative Compl. Ther. 9, 327-33210.1089/107628003322658610
86. PanossianA.HambartsumyanM.HovanissianA.GabrielyanE.WilkmanG. (2007). The adaptogens Rhodiola and Schizandra modify the response to immobilization stress in rabbits by suppressing the increase of phosphorylated stress-activated protein kinase, nitric oxide and cortisol. Drug Target Instights 1, 39-54PMC315522321901061
87. PanossianA.HovhannisyanA.AbrahamyanH.WikmanG. (2010). "Pharmacokinetics of active constituents of Rhodiola rosea L. special extract SHR-5," in Comprehensive Bioactive Natural Products Vol. 2: Efficacy, Safety & Clinical Evaluation (Part-1), ed. GuptaV. K. (New Dehli: Studium Press LLC), 1-23
88. PanossianA.NikoyanN.OhanyanN.HovhannisyanA.AbrahamyanH.GabrielyanE. (2008). Comparative study of Rhodiola preparations on behavioral despair of rats. Phytomedicine 15, 84-9110.1016/j.phymed.2007.10.00318054474
89. PanossianA.WagnerH. (2005). Stimulating effect of adaptogens: an overview with particular reference to their efficacy following single dose administration. Phytother. Res. 19, 819-83810.1002/ptr.175116261511
90. PanossianA.WagnerH. (2011). Adaptogens: a review of their history, biological activity, and clinical benefits. HerbalGram 90, 52-63
91. PanossianA.WikmanG. (2008). Pharmacology of Schisandra chinensis Bail.: an overview of Russian research and uses in medicine. J. Ethnopharmacol. 118, 183-21210.1016/j.jep.2008.04.02018515024
92. PanossianA.WikmanG. (2009). Evidence-based efficacy of adaptogens in fatigue, and molecular mechanisms related to their stress- protective activity. Curr. Clin. Pharmacol. 4, 198-21910.2174/15748840978937531119500070
93. PanossianA.WikmanG. (2010). Effects of adaptogens on the central nervous system and the molecular mechanisms associated with their stress-protective activity. Pharmaceuticals 3, 188-22410.3390/ph3010188PMC399102627713248
94. PanossianA.WikmanG.KaurP.AseaA. (2009). Adaptogens exert a stress-protective effect by modulation of expression of molecular chaperones. Phytomedicine 16, 617-62210.1016/j.phymed.2008.12.00319188053
95. PanossianA.WikmanG.KaurP.AseaA. (2012). Adaptogens stimulate neuropeptide Y and Hsp72 expression and release in neuroglia cells. Front. Neurosci. 6:610.3389/fnins.2012.0000622347152PMC3269752
96. PanossianA.WikmanG.SarrisJ. (2011). Rosenroot (Rhodiola rosea): traditional use, chemical composition, pharmacology and clinical efficacy. Phytomedicine 17, 481-49310.1016/j.phymed.2010.02.00220378318
97. PanossianA.WikmanG.WagnerH. (1999a). Plant adaptogens. III. earlier and more recent aspects and concepts on their mode of action. Phytomedicine 6, 287-30010.1016/S0944-7113(99)80023-310589450
98. PanossianA.GabrielianE.WagnerH. (1999b). On the mechanism of action of plant adaptogens with particular references on Cucuirbitacin R Diglugoside. Phytomedicine 6, 147-15510.1016/S0944-7113(99)80023-310439478
99. PrattB. W. (1992). Control of steroid receptor function and cytoplasmatic-nuclear transport by heat shock proteins. Bioessays 14, 841- 84810.1002/bies.9501412091365900
100. ProdiusP. A.ManukhinaE. B.BulanovA. E.WikmanG.MalyshevI. I. (1997). [Adaptogen ADAPT modulates synthesis of inducible stress protective protein HSP 70 and increases organism resistance to heat shock.] Biull. Eksp. Biol. Med. 123, 629-63110.1007/ BF024580739280512
101. QuZ. Q.ZhouY.ZengY. S.LiY.ChungP. (2009). Pretreatment with Rhodiola rosea extract reduces cognitive impairment induced by intracerebroventricular streptozotocin in rats: implication of anti-oxidative and neuroprotective effects. Biomed. Environ. Sci. 22, 318- 32610.1016/S0895-3988(09)60062-319950527
102. RothB. L.WillinsD. L.KroezeW. K. (1998). G protein-coupled receptor (GPCR) trafficking in the central nervous system: relevance for drugs of abuse. Drug Alcohol Depend. 51, 73-8510.1016/S0376-8716(98)00067-29716931
103. SamuelssonG.BohlinL. (2009). Drugs of Natural Origin: A Treatise of Pharmacognosy, 6th Edn Stockholm: Swedish Academy of Phramaceutical Sciences
104. SarkisovD. V.WangS. S. (2008). Order-dependent coincidence detection in cerebellar Purkinje neurons at the inositol trisphosphate receptor. J. Neurosci. 28, 133-14210.1523/JNEUROSCI.1729-07.200818171931PMC6671165
105. SarrisJ. (2007). Herbal medicines in the treatment of psychiatric disorders: a systematic review. Phytother. Res. 21, 703-71610.1002/ptr. 218717562566
106. SarrisJ.NgC. H.SchweitzerI. (2012). `Omic' genetic technologies for herbal medicines in psychiatry. Phytother. Res. 26, 522- 52710.1002/ptr.357321915930
107. SarrisJ.PanossianA.SchweitzerI.StoughC.ScholeyA. (2011). Herbal medicine for depression, anxiety and insomnia: a review of psychopharmacology and clinical evidence. Eur. Neuropsychopharmacol. 21, 841-86010.1016/j.euroneuro.2011.04.00221601431
108. SelyeH. (1950). Stress. Montreal: Acta Medical Publisher
109. ShiT. Y.FengS. F.XingJ. H.WuY. M.LiX. Q.ZhangN. (2012). Neuroprotective effects of Salidroside and its analogue tyrosol galactoside against focal cerebral ischemia in vivo and H2O2-induced neurotoxicity in vitro. Neurotox. Res. 21, 358-36710.1007/ s12640-011-9290-722095090
110. ShupnikM. A.GordonM. S.ChinW. W. (1989). Tissue-specific regulation of rat estrogen receptor mRNAs. Mol. Endocrinol. 3, 660- 66510.1210/mend-3-4-6602725529
111. SimerlyR. B.YoungB. J. (1991). Regulation of estrogen receptor messenger ribonucleic acid in rat hypothalamus by sex steroid hormones. Mol. Endocrinol. 5, 424-43210.1210/mend-5-3-4241890991
112. SpenceaR. D.HambybM. E.UmedaaE.ItohaN.DuaS.WisdomaA. J. (2011). Neuroprotection mediated through estrogen receptor- in astrocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 8867-887210.1073/pnas.110383310821555578PMC3102368
113. SteinG. H. (1979). T98G: an anchorage-independent human tumor cell line that exhibits stationary phase G1 arrest in vitro. J. Cell. Physiol. 99, 43-5410.1002/jcp.1040990107222778
114. StutzmannG. E. (2005). Calcium dysregulation, IP3 signaling, and Alzheimer's disease. Neuroscientist 11, 110- 11110.1177/107385840427089915746379
115. SuC.RybalchenkoN.SchreihoferD. A.SinghM.AbbassiB.CunninghamR. L. (2012). Cell models for the study of sex steroid hormone neurobiology. J. Steroids Horm. Sci. S2 Available at: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3408626/ 10.4172/2157-7536.s2-003PMC340862622860237
116. TaussigR.GilmanA. G. (1995). Mammalian membrane-bound adenylyl cyclases. J. Biol. Chem. 27, 1-4781436010.1074/jbc.270.1.1
117. TeesaluT.KullaA.SimiskerA.SirnV.LawrenceD. A.AsserT. (2004). Tissue plasminogen activator and neuroserpin are widely expressed in the human central nervous system. Thromb. Haemost. 92, 358-3681526983310.1160/TH02-12-0310
118. UllianE. M.SappersteinS. K.ChristophersonK. S.BarresB. A. (2001). Control of synapse number by glia. Science 291, 657-66110.1126/ science.291.5504.65711158678
119. Ulrich-MerzenichG.ZeitlerH.JobstD.PanekD.VetterH.WagnerH. (2007). Application of the "-Omic-" technologies in phytomedicine. Phytomedicine 14, 70-8210.1016/j.phymed.2006.11.01117188482
120. VandammeJ.CastermansD.TheveleinJ. M. (2012). Molecular mechanisms of feedback inhibition of protein kinase A on intracellular cAMP accumulation. Cell. Signal. 24, 1610-161810.1016/j.cellsig.2012.04.00122522182
121. Von ZastrowM. (2002). "Regulation of G protein coupled receptors by phosphorylation and endocytosis," in Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress, Chap. 5, eds DavisK. L.CharneyD.CoyleJ. T.NemeroffC. (Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins), 59-70
122. WagnerH.NorrH.WinterhoffH. (1994). Plant adaptogens. Phytomedicine 1, 63-7610.1016/S0944-7113(11)80068-123195818
123. WalshD. A.Van PattenS. M. (1994). Multiple pathway signal transduction by the cAMP-dependent protein kinase. FASEB J. 8, 1227- 1236800173410.1096/fasebj.8.15.8001734
124. WangB. L.HuJ. P.TanW.ShengL.ChenH.LiY. (2008). Simultaneous quantification of four active schisandra lignans from a traditional Chinese medicine Schisandra chinensis (Wuweizi) in rat plasma using liquid chromatography/mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 865, 114-12010.1016/j.jchromb.2008.02.01618339588
125. WangM.GamoN. J.YangY.JinL. E.WangX. J.LaubachM. (2011). Neuronal basis of age-related working memory decline. Nature 476, 210-21310.1038/nature1024321796118PMC3193794
126. WangM.RamosB. P.PaspalasC. D.ShuY.SimenA.DuqueA. (2007). Alpha2A-adrenoceptors strengthen working memory networks by inhibiting cAMP-HCN channel signaling in prefrontal cortex. Cell 129, 397-41010.1016/j.cell.2007.03.01517448997
127. WelshonsW. V.LiebermanM. E.GorskiJ. (1984). Nuclear localization of unoccupied oestrogen receptors. Nature 307, 747- 74910.1038/307747a06700705
128. WengS.TangJ.WangG.WangX.WangH. (2007). Comparison of the addition of Siberian Ginseng (Acanthopanax senticosus) versus Fluoxetine to lithium for the treatment of bipolar disorder in adolescents: a randomized, double blind trial. Curr. Ther. Res. Clin. Exp. 68, 280-29010.1016/j.curtheres.2007.08.004PMC396728924683218
129. WettschureckN.OffermannsS. (2005). Mammalian G proteins and their cell type specific functions. Physiol. Rev. 85, 1159- 120410.1152/physrev.00003.200516183910
130. WiegantF. A.SurinovaS.YtsmaE.Langelaar-MakkinjeM.WikmanG.PostJ. A. (2009). Plant adaptogens increase lifespan and stress resistance in C. elegans. Biogerontology 10, 27-4210.1007/s10522-008-9151-918536978
131. WiegantF. A. C.LimandjajaG.de PootS. A. H.BaydaL. A.VorontsovaO. N.ZeninaT. A. (2008). "Plant adaptogens activate cellular adaptive mechanisms by causing mild damage," in Adaptation Biology and Medicine: Health Potentials, Vol. 5, eds LukyanovaL.TakedaN.SingalP. K. (New Delhi: Narosa Publishers), 319-332
132. WikmanG.PanossianA. (2004). Medical herbal extract Carpediol for the treating of depression. US Patent 20040131708.
133. YaghmaieF.SaeedO.GaranS. A.FreitagW.TimirasP. S.SternbergH. (2005). Caloric restriction reduces cell loss and maintains estrogen receptor-alpha immunoreactivity in the pre-optic hypothalamus of female B6D2F1 mice. Neuroendocrinol. Lett. 26, 197-20315990721
134. YakelJ. L. (2000). "The 5-HT3 receptor channel: function, activation and regulation," in Pharmacology of Ionic Channel Function: Activators and Inhibitors (Handbook of Experimental Pharmacology), Vol. 147, eds EndoM.KurachiY.MishinaM. (Berlin: Springer- Verlag), 541-560
135. YamasakiT.TakahashiA.PanJ.YamaguchiN.YokoyamaK. K. (2009). Phosphorylation of activation transcription factor-2 at serine 121 by protein kinase C controls c-Jun-mediated activation of transcription. J. Biol. Chem. 284, 8567-858110.1074/ jbc.M80871920019176525PMC2659215
136. YangP. C.YangC. H.HuangC. C.HsuK. S. (2008). Phosphatidylinositol 3-kinase activation is required for stress protocol-induced modification of hippocampal synaptic plasticity. J. Biol. Chem. 283, 2631-264310.1074/jbc.M70679520018057005
137. YepesM.LawrenceD. A. (2004). Neuroserpin: a selective inhibitor of tissue-type plasminogen activator in the central nervous system. Thromb. Haemost. 91, 457-4641498322010.1160/TH03-12-0766
138. ZengK. W.ZhangT.FuH.LiuG. X.WangX. M. (2012). Schisandrin B exerts anti-neuroinflammatory activity by inhibiting the Toll-like receptor 4-dependent MyD88/IKK/NF-B signaling pathway in lipopolysaccharide-induced microglia. Eur. J. Pharmacol. 692, 29- 3710.1016/j.ejphar.2012.05.03022698579
139. ZhangL.YuH.SunY.LinX.ChenB.TanC. (2007). Protective effects of salidroside on hydrogen peroxide-induced apoptosis in SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Eur. J. Pharmacol. 564, 18-2510.1016/j.ejphar.2007.01.08917349619
140. ZhangL.YuH.ZhaoX.LinX.TanC.CaoG. (2010). Neuroprotective effects of salidroside against beta-amyloid-induced oxidative stress in SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neurochem. Int. 57, 547-55510.1016/j.neuint.2010.05.00120615444
141. ZhuS.WangY.ChenM.JinJ.QiuY.HuangM. (2012). Protective effect of schisandrin B against cyclosporine A-induced nephrotoxicity in vitro and in vivo. Am. J. Chin. Med. 40, 551-56610.1142/S0192415X1250042522745070